小小肽|海参多肽的研究进展

栏目:学术成果 发布时间:2013-11-07
海参多肽是以新鲜海参为原料,经过蛋白酶酶解,分离纯化得到的具有功能特性的生物活性物质,研究发现海参多肽具有抗氧化、降血压、抗肿瘤、抗疲劳等多种功能。本文综述了不同种类的海参多肽的生物活性、制备与精制方法以及结构鉴定等方面的研究进展。

摘 要: 海参多肽是以新鲜海参为原料,经过蛋白酶酶解,分离纯化得到的具有功能特性的生物活性物质,研究发现海参多肽具有抗氧化、降血压、抗肿瘤、抗疲劳等多种功能。本文综述了不同种类的海参多肽的生物活性、制备与精制方法以及结构鉴定等方面的研究进展。

关键词: 海参多肽,生物活性,精制,结构鉴定


海参( sea cucumberLudwigothurea grisea) 属棘皮动物门海参纲动物,根据海参的外部特征,将其分为四个目九个科( 枝手目: 瓜参科沙鸡子科高球参科; 楣手目: 辛那参科海参科刺参科; 芋参目: 芋参科; 无足目: 锚海参科指参科) 全世界约有1100种海参,其中40种可食用,我国有100多种,其中20多种可食用1干制的海参蛋白质的成分很高,接近90% ,多糖6%左右,脂质约占 4% ,含有少量核酸以及钙硒等微量元素2不同种类的海参由于生长环境的不同,其营养价值和生物活性也有所差异,其中以刺参营养价值最高,属于海参中的精品,被称为参中之冠2自古以来,海参作为营养食品和保健食品被广泛使用,海参常被制成海参干粉海参熟制品海参罐头等,大量的应用是把海参作为食品原料进行简单的初级加工海参多肽是以新鲜海参为原料,经过蛋白酶酶解,分离纯化得到的具有功能特性的生物活性物质,研究发现海参多肽具有抗氧化降血压抗肿瘤抗疲劳等多种功能本文主要对海参多肽的生物活性以及制备分离纯化方法进行介绍,为海参多肽在食品医药保健品等行业的应用提供依据和思路

1 海参多肽的生物活性 

1.1 抗氧化活性 

生物体内氧自由基(oxygen-derived free adicals.OFR) ,主要包括超氧阴离子( O2-·) 羟自由基(·OH)羟过氧自由基( HOO·)有机过氧自由基( ROOy)等,在生物体内不断产生,也不断地被分解,处于动态平衡之中,维持在一个正常的生理水平上若体内自由基过量,可损伤体内的蛋白质核酸和生物膜,引起各种疾病而自由基清除剂可清除体内自由基,保护机体免受氧化损害因此,近年来,对体内自由基清除剂的研究备受关注,如超氧化物歧化酶(superoxide dismutaseSOD)过氧化氢酶(catalaseCAT)谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidaseGSHPX )抗氧化剂谷胱甘肽(glutathioneGSH)和维生素等3

海参是一种高蛋白低脂肪的食品,不仅体腔液内GSH以及总抗氧化能力的含量高4,而且动物实验证明海参多肽可以提高机体内的抗氧化酶的酶活侯付景等5通过小鼠喂养实验表明东海乌参(Acaudina leucoprocta)水解液使小鼠血清和肝脏组织中的SODGSH-PX 活力明显提高,MDA(丙二醛)含量显著降低,有效清除体内堆积的自由基有关研究表明,海参多肽抗氧化性的强弱主要与多肽的氨基酸组成氨基酸序列以及空间构象有关6而目前研究主要集中在不同海参多肽的抗氧化能力与多肽分子量和浓度之间的关系,赵玲等7测定比较了大西洋海参(Holothuria coluber Semper)东海海参(Acaudina mobpadioides Semper)刺参( Apostichopus japonicus)和加州拟刺参( Parastichopus californicus)4种海参多肽的抗氧化活性,其结果显示大西洋海参多肽刺参多肽和加州拟刺参多肽分别对·OHDPPH·(11-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)O2-·的清除能力最强不仅新鲜海参多肽具有良好的抗氧化能力,有研究表明带有内脏的干制海参制备的多肽具有更高的抗氧化能力8,并且不同浓度海参多肽抗氧化能力也不同苏永昌等9的研究表明随着海地瓜(Acaudina molpadioides) 多肽浓度的增加,多肽对羟自由基的清除能力迅速上升,当多肽浓度大于 20mg /mL,多肽清除羟自由基能力则表现为平缓的上升趋势,其清除羟自由基和超氧自由基的IC50( half maximal inhibitory concentration of a substance,半抑制浓度)分别为12.523.6mg /mL此外,王静等10还发现不同分子量海参(Apostichopus japonicus)多肽清除·OHO2-·H2O2IC50也不同,其结果表明: 4种分子量范围的海参多肽清除3种氧自由基的能力存在差异,大小顺序为CPHIV(<3ku)>CPHIII(35ku)> CPHII(510ku> CPHI(>10ku),分子量越小的海参多肽清除3种氧自由基的能力越大,4种分子量范围的海参多肽清除O2-·的效果最好,其次是H2O2,最后是·OH

1.2 降血压活性 

随着人们生活水平的不断提高,高蛋白高脂肪的摄食越来越大众化,高血压的患病率也逐步上升血管紧张素转换酶(Angiotension--converting EnzymeACE)是肾素-血管紧张素系统( Renin-AngiotensnisystmeARS)和激肽释放酶-激肽系统(Kal1ikrein-KininSystmeKKS)的关键酶11,在ARS中,ACE将无升压活性的血管紧张素水解为具有升压活性的血管紧张素,在KKS中,ACE使具有降压活性的缓激肽降解失去降血压活性通过以上两个途径,ACE参与体内血压调节,造成血压的升高,引发高血压12

海参多肽作为一种有效的ACE抑制剂,就是通过抑制血浆和血管内皮细胞ACE的活性从而达到降低血压的目的的有研究表明,分子量<2ku的海参多肽具有较强的ACE抑制活性,其中海地瓜体壁蛋白水解物<2ku的多肽ACE抑制活性的IC50值达0.615mg /mL13不同酶的酶活和作用位点的不同导致酶解产物的分子量分布不同,影响其ACE抑制活性赵元晖等14比较了型胶原酶胰蛋白酶木瓜蛋白酶菠萝蛋白酶3942中性酶Alcalase 2.4L六种海地瓜蛋白水解液ACE抑制活性的大小,结果表明: 6种蛋白酶水解液对ACE抑制效果从大到小依次为: 菠萝蛋白酶水解液>型胶原酶水解液>Alcalase酶水解液>3942中性酶水解液>木瓜蛋白酶水解液>胰蛋白酶水解液Forghania15也比较了糙海参(Golden sea cucumber)六种不同酶酶解液的ACE抑制活性的大小,发现碱性蛋白酶酶解液具有最高的ACE抑制活性,IC500.41mg /mL,其次为风味蛋白酶,然后是菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶,最后为胰蛋白酶和复合蛋白酶海地瓜酶解物经过类蛋白反应(类蛋白反应是指利用浓缩的蛋白质在合适的条件下经蛋白酶的作用合成的类蛋白产品)修饰后,ACE抑制活性能够明显升高16ACE抑制活性的大小主要与其ACE抑制肽的C-末端氨基酸序列有关,其中主要与三肽序列有关,Monti17 研究证实,ACE抑制肽的C-末端三肽序列含疏水性氨基酸(芳香族氨基酸或带支链氨基酸),活性较强,若其中C-末端三肽序列中含有一个脯氨酸或者含有一个带正电的氨基酸如赖氨酸(ε-氨基带正电荷)精氨酸(胍基带正电荷),其活性也会明显增强

1.3 其他生物活性 

海参多肽除具有抗氧化和降血压活性之外,还具有降血脂抗疲劳抗癌以及镇痛等生物活性Rodriguez18-19将从海参(Holothuria forskali)酶解液中提取的多肽喂养大鼠,检测其对大鼠血脂的影响,结果显示海参多肽在明显升高血清高密度脂蛋白的含量的同时降低血清甘油三酯的的水平,从而达到降血脂的效果王海涛等20研究结果发现刺参(Apostichopus japonicus)多肽具有比较好的抗疲劳的效果,其作用机理主要为能够显著降低运动后小鼠的血尿素氮含量以及提高其肝糖原含量,且功效随着灌胃剂量的提高而增强付学军21进一步研究了不同浓度的低分子量的海参肽对小鼠抗疲劳的作用,结果发现低分子量的海参肽对小鼠的体重没有明显的影响,具有显著的抗疲劳作用王奇等22也验证了海参的抗疲劳活性,通过动物实验还发现东海海参多肽能够提高小鼠的记忆力,其作用机制可能是上调小鼠内记忆相关基因转录水平的表达卢连华23和谢永玲24研究了海参肽对小鼠的免疫调节功能的影响,结果表明海参肽能够增强小鼠体液免疫功能非特异性免疫功能以及自然杀伤(HK)细胞王奕25通过动物实验研究日本刺参(Apostichopus japonicus)多肽的抗肿瘤作用,结果表明不同剂量组的日本刺参胶原蛋白多肽均能够显著抑制小鼠S180肉瘤的生长有研究还表明鲜海参的提取物对体外培养的人胃癌细胞栋(MGC)人肝癌细胞株(7402)以及小鼠的乳腺肉瘤细胞栋(EMT6 )的生长有显著的抑制作用26Shinichi27还从日本刺参中分离出一种五肽和七肽,其研究结果表明这两种小分子的多肽能够促进生殖细胞的形成和卵母细胞的成熟除此之外,Ridzwan28利用动物实验证明玉足海参(Holothuria leucospilota)图纹白尼参( Bohadschia marmorata)的水提取物糙刺参(Stichopus hermanii)的腹腔液都具有良好的镇痛作用海参多肽的多种生物活性正在逐渐被人们认识,大量的动物实验证明了海参作为保健品和功能食品的潜力

2 海参多肽的提取精制以及结构鉴定

近年来,对于不同种类海参多肽的制取精制已经有较多的报道,但是对于其活性结构的鉴定研究才刚刚开始目前,海参多肽的制取常采用酶解法,制备不同生活活性的海参多肽选择的酶也不尽相同,常采用复合蛋白酶和中性蛋白酶; 精制主要围绕脱盐脱色进行,常用活性炭或者大孔树脂物理吸附进行 脱 色,柱层析进行脱盐,制备高商品性状的产品

2.1 海参多肽的制取

生物活性肽的生产方法主要包括从自然界中提取天然活性物质蛋白质降解以及化学合成法29其中,在海参多肽的制取过程中,应用最成熟的技术为蛋白质定向酶切,即利用不同的酶或者微生物对海参进行蛋白质降解获得具有不同功能的生物活性多肽30在酶解过程中,通过酶种类的选择,酶解条件的控制(加酶量反应温度反应时间底物浓度)来得到具有特定生理功能的生物活性肽31

向怡卉等32利用复合蛋白酶水解海参生殖腺,制得水解度达50%的海参蛋白液水解度是衡量水解程度的一个重要指标,水解度越高,水解得越彻底,但多肽的含量不一定高因此,为了得到更高含量的多肽,张彧等33选择多肽得率作为目标来控制海参的酶解,得到多肽的得率为42%左右的海参多肽海参多肽的肽链中含有羟基氨基和羧基等多种亲水基团,能够与水分子结合,是很好的吸湿剂,同时由于其分子量小,很容易被皮肤吸收,不但维持肌肤的吸水还具有良好的保湿效果,因此,其吸湿性和保湿性同样受到人们的关注,朱洪珍等34选择中性蛋白酶对海地瓜进行酶解,得到吸湿率和保湿率分别为6.11%81.23% 的海地瓜胶原蛋白多肽人们在研究选择合适的外加酶进行海参多肽的酶解的同时也在关注海参自身的酶对其酶解的影响郑杰等35的研究进一步验证了海参肠内酶的作用,其研究表明,海参肠自溶水解物具有一定的DPPH· (11-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)清除能力Fe2 +螯合能力和还原能力结合之前的研究以及实际生产的需要,王静等36将海参体内酶与外加酶结合使用,将完整的海参匀浆后诱导其自溶,以自溶后水解液为底物,加入复合蛋白酶进行二次水解,从而提高酶解效率,二次水解后海参多肽的得率从34%提高到约为60%

2.2 海参多肽的精制 

海参多肽的精制过程一般包括预处理分离纯化和纯度测定四个阶段,其中纯化是最为关键的阶段利用酶解法制备海参多肽的过程中主要存在着盐含量过高颜色过深等问题,因此海参多肽的纯化主要围绕着脱盐脱色进行在酶解过程中,根据不同的酶的最适pH,必须通过不断的加酸或者碱来维持体系pH的稳定,因此水解物中含有一定量的盐分,这些盐分对海参多肽的理化性质适用范围和生物活性产生影响目前常用的脱盐的方法有离子交换树脂法透析法和超滤法王静等36采用透析法和超滤法对刺参多肽进行脱盐纯化,脱盐率达到85%左右海参体壁的大量色素经过酶解沉积到海参多肽中,导致海参多肽颜色过深影响其开发利用,张翠玉等37研究了NKA-9AB-8D392D280D101D315 六种不同的大孔树脂对海地瓜多肽的脱色效果结果表明: 树脂D392可较好的用于海地瓜多肽的脱色,脱色率达到83. 2%,多肽保留率为80.5%海参经过酶解得到多肽的分子量分布大约为5003000u,分子量的不同对多肽的抗氧化性ACE抑制活性等功能都有影响,分离并纯化不同分子量范围的多肽对研究其生物活性具有重要意义,目前常用的纯化方法主要有: 柱层析高效液相色谱聚丙烯酰胺凝胶电泳等赵元晖等14利用Sephadex G-25凝胶柱层析SP Sephadex C-25阳离子交换层析反相高效液相色谱层析对海地瓜复合酶水解产物进行分离纯化,得到两种高活性高纯度的ACE抑制肽王洪涛等38将海参酶解液先经过醇沉离心分离海参多肽和蛋白,再对海参蛋白和多糖分别进行纯化,得到较高纯度的海参多肽和多糖,使得海参的营养价值得到更好地应用

2.3 海参多肽的结构鉴定 

迄今为止,国内外的学者主要对海参中的一些活性成分比如海参多糖的提取分离纯化以及结构鉴定进行了较多的报道,但是对于海参多肽的结构组成的研究比较少有研究表明,海洋多肽的生物活性与多肽的氨基酸序列多肽的结构疏水性以及所带的电荷有关39,因此测定海参多肽的结构为我们更好的研究海参生物活性提供基础目前国外学者对氨基酸序列的测定做了大量的工作, Birenhenide40从海参中分离出两种多肽,一种为Pro-Leu-Gly-Tyr-Met-Phe-Arg,另一种为 Pro-Leu-Gly-Tyr-Met-Phe-Arg,属于神经肽类,主要影响海参真皮的硬度及弹性Miranda41从海参(Holothuria glaberrima)中分离出两种肽,一种为Gly-Phe-Ser-Lys-Leu-Tyr-Phe-NH2,命名为GFSKLYFamide,另一种为Ser-Gly-Tyr-Ser-Vak-Leu-Tyr-Phe-NH2,命名为SGYSVLYFamide,其中GFSKLYFamide对海参神经肌肉的结缔组织有重要影响Sunil Kumar 42从海参(Caudina Arenicola)中分离出一种四肽,经测定得出其结构为Pro-Glu-Leu-Leu,是C球蛋白的94-97片断我国学者Liu Zunying43从巨型红海参(Parastichopus californicus)中提取胃蛋白酶可溶性胶原蛋白属于型胶原蛋白,但在氨基酸组成与型胶原蛋白有一些不同赵元晖等14应用纳升电喷雾四极杆-飞行时间串联质谱(Nano-ESI-Ms/ Ms)技术,对从海地瓜中分离得到的ACE抑制肽 P1P2进行结构鉴定P1的精确分子量为1629.7u,氨基酸序列为YYLEMDFLLFNY; P2的精确分子量为1034.5u,氨基酸序列为MEGAQEAQGD但是海参多肽的氨基酸序列和结构对其生物活性的具体影响机制还需要进一步的研究

3 展望 

近年来,海参多肽的研究取得了较大的进展,但和某些功能性多肽的研究相比,还存在着一定的差距对于不同种类海参多肽的提取条件的优化分离纯化和生物活性等方面的研究已较为成熟,而其结构测定和构效关系的研究却非常有限目前,虽然人们对海参多肽的生理功能做了大量的研究,但是大部分研究比较浅显,对具体的作用过程和作用机制了解的不够详细此外,海参种类繁多,目前的研究也大部分局限在一些价格比较昂贵的海参品种上,比如刺参糙参,还有其它品种的海参需要进行进一步的开发和利用

今后,对海参多肽的研究主要着重于以下几个方面:

不同海参多肽的结构测定: 从目前的研究来看,由于海参的种类繁多,不同种类海参多肽的结构不同,不同水解程度得到的不同分子量的多肽的结构也不同,从而增加了海参多肽结构测定的难度但是海参多肽的结构是其生理功能的基础,更深入的工作有待于进一步开展

海参多肽的修饰与构效关系的研究: 多肽的修饰可能导致其生物活性发生变化,比如多肽的修饰可以使活性低或者不具有活性的海参多肽具有较高的活性,因此对其构效关系的研究有助于海参多肽以及其衍生物的制备

海参多肽生物活性的作用机制的研究: 目前对于海参多肽的生物活性的研究的文章较多,但只通过实验报道了结果以及可能的作用机制对于海参多肽作用机制的更全面系统的报道需要进一步的探讨

应用研究: 进一步开发其它种类的海参多肽,研究海参多肽的功能性成分的高效制取和分离纯化,实现海参多肽的大规模生产,并应用于食品和医药制品中,发挥其更加重要的作用


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